Primer Design Tutorial

¿Necesitas diseñar un par de cebadores (primers) específicos para tu secuencia de interés?

 ¡Estás en el lugar correcto! Este tutorial te explica cómo usar Primer3Plus para generar cebadores para cualquier secuencia de codificación.

Antes de comenzar a diseñar tus cebadores, encuentra sus secuencias:

• Por favor, consulta el tutorial "Buscar gen" y/o "Búsqueda de similitud de secuencia" para saber cómo encontrar tu secuencia de interés.
• Una vez que lo encuentres, haz clic en el nombre y luego en la pestaña "Secuencias" en la columna de la izquierda.
• Bajo la secuencia de ARNm, está disponible el enlace "Diseño de Cebador para ..."

Diseña tus cebadores:

• El menú "Principal", que se encuentra en el sitio web de Primer3Plus, ya tendrá tu secuencia de interés en el cuadro de secuencia.
  • Las herramientas en la parte inferior te permiten incluir o excluir parte de la secuencia del diseño del cebador y decirle al sistema si ya tienes un cebador (izquierda/adelante o derecha/atrás) y necesitas diseñar solo el otro.
• Comprende el menú "Configuración general":
  • Los cebadores se pueden personalizar de muchas formas diferentes, por ejemplo, la longitud óptima del cebador, la longitud óptima del producto de amplificación del cebador, la temperatura óptima de fusión (Tm) y el porcentaje óptimo de Guanina y Citosina (GC%).
    • El tamaño del cebador suele ser de 20 pares de bases (pb) (mínimo 18 pb y máximo 27 pb).
    • La temperatura de fusión (Tm) del cebador generalmente se fija en alrededor de 58°C para fines de clonación (mínimo 56°C y máximo 60°C); pero usualmente es más alto si los cebadores se usan para otro propósito.
    • El GC% de un cebador suele ser del 50% (mínimo 20% y máximo 80%).
    • Todas las demás características son bastante estándar.
    • Los usuarios expertos pueden usar los menús "Configuraciones avanzadas", "Oligo interno", "Pesos de penalización" y "Calidad de secuencia" para personalizar las características de los cebadores.
    • Se puede encontrar más información y detalles sobre el diseño de cebadores en el enlace que se encuentra en la esquina superior derecha
• Diseña tus cebadores:
  • Haz clic en "Seleccionar cebadores”.
  • El par de cebadores óptimo diseñado utilizando tus características requeridas se muestra en la parte superior de la página.
  • Para este par de cebadores se informa la posición en la secuencia, la longitud, la Tm y el GC%.
  • También se informa para el par de cebadores el tamaño del producto amplificado y cualquier alineamiento posible entre un cebador F y un cebador R.
  • Tras la descripción general del par de cebadores, se muestra la secuencia completa y se resalta el par de cebadores óptimo.
  • Después de la secuencia, se informan otros 4 pares de cebadores junto con todas las características mencionadas.
• Ordena tus cebadores:
  • Haz clic en "Enviar a Primer3Manager" en el par de cebadores que seleccionaste.
  • En esta ventana puedes hacer clic en "¡Comprobar!" para recuperar todas las características de cada cebador seleccionado y "¡BLAST!" para dirigirlo directamente a la herramienta NCBI BLAST, con el fin de verificar que tu cebador es capaz de unirse solo a tu secuencia de interés o también comprobar que tus cebadores no te darán amplificaciones inespecíficas.
  • Cuando hagas clic en "Solicitar el cebador seleccionado", tendrás una lista de nombres de cebadores y secuencias de cebadores que puedes copiar, pegar y enviar a la dirección de correo electrónico de la compañía que te suministrará el cebador.