El ARNi revela la función del gen debido a la capacidad del protocolo para destruir el ARNm del gen de interés que da como resultado un fenotipo. El aspecto más desafiante de este experimento es la clonación de genes y, para las clases de nivel inferior, la preparación de alimentos.
MATERIALES REQUERIDOS |
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TRIzol® |
Tubos de plástico (15, 1.5 and 0.2 ml) y pestels |
Cloroformo, isopropanol y etanol |
Purificador de agua Milli-Q |
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 |
Kit SuperScript III (Oligo (dT)20 primer, dNTPs Mix, 5x tampón de primera cadena, DTT, inhibidor de RNasa y SuperScript III retro transcriptasa) |
Tubos de plástico (0.2 ml) |
Termociclador |
Cebadores F and R (Tabla 6) |
Phusion ADN polimerasa junto con 5x tampones de alta fidelidad, dNTPs mix, MgCl2 |
Agarosa y 1x tampón TAE |
Cámara de electroforesis |
Colorante de carga y marcador de ADN de 1 kb |
Transiluminador UV |
Kit de purificación QIAquick PCR o QIAquick Gel Extraction Kit (cuchilla y termobloque) |
Plásmido PR-T4P |
Enzima de restricción Smal y10x NEB tampón #2 |
T4 polimerasa, su tampón y BSA |
En cuanto al protocolo WISH, los primeros pasos del protocolo ARNi en planarias son: buscar secuencias específicas de especies de ARNm que correspondan a los genes de interés y diseñar cebadores F y R (Tabla 6) como se describe en la Sección 3.1, producir el ADNc y clonar el gen de interés como se describe en la Sección 3.2, transformar las bacterias y secuenciar la inserción como se describe en la Sección 3.3.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Hielo y contenedores |
Cuchilla y licuadora |
Molino de alimentos o tamiz |
Cucharas |
Plato pequeño de Petri (35 x 10 mm, 5 ml) o envoltura de plástico |
La pasta de hígado de ternera fresca se prepara cortándolo y homogeneizándolo en una licuadora. El hígado debe mantenerse en hielo durante todo el proceso para preservarlo. Los pasos para la preparación del alimento de ARNi son:
MATERIALES REQUERIDOS |
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Opción 2: stock de glicerol de Escherichia coli HT115 transformada |
Caldo 2x YT medio-Kan (50 μg / ml) Tet (12.5 μg / ml) |
Incubadora a 37°C y agitador |
Tubo de plástico (1.5 and 50 ml) |
Espectrofotómetro |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) |
Pasta de hígado de ternera (Sección 4.2) y colorante alimenticio rojo |
Centrífuga y su adaptador para tubos de 50 ml |
Instant Ocean® sal marina o 1x agua Montjuïc |
Toalla de papel, agua Milli-Q y hielo |
El primer método de ARNi implica inducir bacterias transformadas con el constructo para transcribir el inserto en el plásmido para generar ARN de doble cadena (ARNds) y luego mezclar estas bacterias con la pasta de hígado. Cuando las planarias comen el alimento, las células planarias toman el ARNds y activan la ruta que degrada el ARNm con una secuencia complementaria a una de sus cadenas. Este método funciona para Girardia sp. y D. dorotocephala, pero P. morgani y P. gracilis no consumen alimentos mezclados con bacterias y es necesario el protocolo informado en la Sección 4.4.
Gracias al fuerte fenotipo demostrado por el ARNi de los dos genes seleccionados (β-catenina-1 y ODF2), 3 alimentaciones de ARNi son suficientes. Siguiendo este protocolo, se pueden preparar 250 ul de alimento de ARNi (3-4 alimentaciones para 30 a 50 gusanos) a partir de 50 ml de cultivo de bacterias transformadas.
Manteniendo el constructo (3 μl) en hielo, se le añadieron 48 μl de cepa competente de Escherichia coli HT115. La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo, y luego se realizó un choque térmico durante 35 segundos a 42°C, después de lo cual el tubo se llevó de vuelta al hielo. Después de 5 minutos, la E. coli transformada se colocó a temperatura ambiente y se añadió 1 ml de Caldo de Luria (LB) sin antibióticos. Las células se colocaron en un agitador a 250 rpm durante 1 hora a 37°C para su recuperación y, finalmente, todo el cultivo de bacterias se movió a 4 ml de un caldo de cultivo de 2x YT medium-Kan (50 μg / ml) -Tet (12,5 μg / ml).
Nota: El stock de glicerol es una mezcla compuesta por 50% de bacterias en caldo de cultivo y 50% de glicerol que puede almacenarse a -80°C durante mucho tiempo y usarse como iniciador para un nuevo cultivo de bacterias, cuando sea necesario. Si se dispone de una reserva de glicerol de bacterias HT115 ya transformadas con el constructo de interés se pueden recoger pocas bacterias de aquí y agregarse a 5 ml de 2x YT medium-Kan (50 μg / ml) -Tet (12,5 μg / ml )
Nota: corta el extremo de la punta para pipetear el hígado.
Nota: usualmente se requiere 1 ul de alimento por gusano.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Phusion ADN polimerasa, junto con tampón GC, cebador T7, dNTPs mix y MgCl2 |
Termociclador y tubo de plástico (0.2 and 1.5 ml) |
Agarosa y tampón TAE 1x |
Cámara de electroforesis |
Colorante de carga y 1 escalera de ADN de 1kb |
Transiluminador UV |
Kit de purificación de QIAquick PCR |
T7 ARN polimerasa junto con su tampón de transcripción, NTPs mix (ATP, CTP, GTP y UTP), inhibidor de RNAsas |
Agua Milli-Q |
Termobloque |
RQ1 DNasa |
Amonio acetato 5M |
Etanol 70% y 100% |
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 |
Pasta de hígado de ternera (Sección 4.2) y colorante alimenticio rojo |
El segundo método para inducir ARNi es mezclar la pasta de hígado con ARNds purificado generado in vitro a partir del constructo de interés. Cuando las planarias comen el alimento, las células planarias toman el ARNds y activan la ruta que degrada el ARNm con una secuencia complementaria a una de sus cadenas. Este método es mejor para P. morgani y P. gracilis, que no comen alimentos mezclados con bacterias.
Una vez que el gen de interés se clonó con éxito, el inserto se amplificó por reacción de PCR, usando el constructo como molde, el cebador T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '), la enzima Phusion ADN polimerasa y su tampón GC (New England Biolabs), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para obtener la cantidad requerida de secuencia de inserción amplificada, se preparan 240 μl (4 reacciones/60 μl en total cada una) de reacción PCR con 100 ng de plantilla en cada reacción. Se utilizó el siguiente programa de PCR de toma de contacto:
Una pequeña alícuota del ADN amplificado (1-2 μl) se ejecutará en gel de agarosa al 1% en 1x TAE para verificar si la reacción funcionó correctamente. El ADN contenido en la alícuota residual (237-238 μl) se purifica con el kit de purificación QIAquick PCR
El ADN purificado fue la plantilla para la Reacción de Transcripción para producir el ARNds. La reacción se realizó mezclando 2.5-3 μg del fragmento de ADN amplificado y purificado con el tampón de transcripción, la mezcla de ribonucleótidos (ATP, CTP, GTP y UTP), el ARN polimerasa T7 (Invitrogen) y el inhibidor de la RNasa (Promega) en agua Milli-Q hasta un volumen final de 200 μl. Incubar la reacción a 37 ° C.
El ARNds se trató con 5 μl de RQ1 DNasa (Promega). La reacción se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente.
El ARNds se precipitó bajo el siguiente protocolo:
Una pequeña alícuota del ARNds sintetizado (2 μl) se ejecutará en gel de agarosa al 0.8% en TAE para comprobar si la reacción funcionó correctamente. Podría suceder que la banda no esté bien definida o no tenga exactamente el tamaño esperado debido a la diferente propiedad de migración del ARNds en comparación con el ADN y el ARN. La concentración del ARNds debe ser de aproximadamente 3-4 μg/μl después de la salida del espectrofotómetro NanoDrop 1000. El ARNds se almacena a -80°C.
El día de la alimentación, el ARNds y una alícuota de pasta de hígado se descongelan. El ARNds se mezcla con el colorante alimentario rojo y luego se añaden a la pasta de hígado y se mezclan con la proporción de hígado:colorante alimentario rojo:ARNds igual a 30:3:5
MATERIALES REQUERIDOS |
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Placas de Petri |
Instant Ocean® Sal Marina y 1x agua de Montjuï |
Opción 1: Pasta de hígado de ternera mezclada con bacterias (Sección 4.2 y 4.3) |
Opción 2: Pasta de hígado de ternera (Sección 4.2), colorante alimentario rojo y ARNd (Sección 4.4) |
Botella flexible o botella estándar |
Contenedor de basura |
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™ |
Opcional para la amputación: etanol, cuchilla |
Los genes sugeridos para el protocolo ARNi tienen un fenotipo realmente pronunciado que aparece después de 3 alimentaciones. Para cada experimento, se usaron 3-5 de control y 3-5 gusanos ARNi, todos de 4-7 mm de largo y que han pasado hambre durante al menos 7-10 días.
Nota: La alimentación para Girardia sp. y D. dorotocephala está lista para usarse; la alimentación para P. morgani y P. gracilis tiene que prepararse fresca, mezclando la pasta de hígado, el colorante rojo y el ARNds en la proporción 30:3:5.
Nota: el fenotipo para ambos genes β-catenina-1 y odf-2 también aparece en los gusanos que no son amputados, pero lleva más tiempo y la eficiencia es menor. Si el investigador está interesado en descubrir la función del gen de interés en la homeostasis de los gusanos, no debería cortar los gusanos e iniciar la observación desde el día posterior a la última alimentación. Si el investigador quiere descubrir la función del gen de interés en la regeneración de los gusanos, debe cortarlos y comparar el proceso de regeneración del fragmento entre el control y los gusanos interferidos.
Especie de planaria | Nombre del gen | Secuencia de Cebador F | Secuencia de Cebador R |
Longitud de secuencia |
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Girardia sp. | beta-catenin | TAGTATGTCAAGGCACAACG | GTATGGCCGATGTTAGTCTG | 2749 |
D. dorotocephala | beta-catenin | TTGGAAAGTCACAGTCACAG | GTGTCTAACATGCACACGTC | 2669 |
P. morgani | beta-catenin | GCCTATCGAACATAAGCATC | GTAGTCAATCGAAGGTCGAG | 3049 |
P. morgani | odf2 | TCAATTGCTCTAGCTGCTTC | AAAGGATCCAAGTCCACATT | 1003 |
P. gracilis | beta-catenin | TGGATTCAGAAGACCAGAAC | CGATCATGTGTGTTTGCTAC | 2613 |