El protocolo WISH es probablemente el experimento más complejo sugerido debido a los muchos pasos y reactivos requeridos. El objetivo de este experimento es mostrar dónde se expresa un gen de interés visualizando su ARNm con una ribosonda capaz de reconocerlo específicamente. El estudiante más valiente y curioso puede explorar el patrón de expresión de genes diferentes de los propuestos si quisiera buscar la secuencia de ARNm, clonarla y producir las ribosondas específicas.
Por otro lado, los estudiantes de cualquier nivel pueden mirar las figuras publicadas en el documento "Práctica, estudios de aula de regeneración y biología de células madre usando planarias de agua dulce" y tratar de diseccionar con el docente los pasos del protocolo.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Conexión a Internet |
Computadora |
Este protocolo WISH es bastante específico y reduce significativamente el riesgo de unión no específica de las ribosondas o de la señal de fondo. En consecuencia, preparamos ribosondas específicas para cada especie de planaria considerada. Para lograr esto, el primer paso es encontrar la secuencia de ARNm del gen de interés, descargarla y diseñar los cebadores específicos.
Entre las herramientas disponibles en este sitio web, la búsqueda de secuencias de ARNm de cuatro especies planarias se proporciona con los tutoriales respectivos.
Si conoces el nombre o la función del gen de interés, consulta el tutorial "Buscar genes planarios basados en el nombre o la función del gen" y utiliza la herramienta "Buscar genes". La herramienta "Búsqueda de similitud en la secuencia" te permite buscar las secuencias planarias que son muy similares a una secuencia ya identificada y disponible en otra especie de planaria (como Schmidtea meditteranea) o en un animal diferente (como el humano Homo sapiens o el ratón Mus musculus). Para aprender a usar esta herramienta, consulta los tutoriales "Buscar genes de planarias basados en la homología de proteínas" y "Buscar genes de planarias basados en la similitud de secuencias".
Una vez que se obtuvo una secuencia de ARNm para cada gen de interés para cada especie de planaria, se diseñaron los cebadores específicos. El tutorial "Diseño de cebador específico para una secuencia de interés" explica cómo explotar correctamente la herramienta "Diseño de cebador" que está disponible cada vez que se encuentra una secuencia de interés.
Se diseñaron un cebador directo (F) y un cebador inverso (R) para cada secuencia de interés para el protocolo de hibridación in situ, identificado en Girardia sp. (Tabla 2) D. dorotocephala (Tabla 3), P. morgani (Tabla 4) y P. gracilis (Tabla 5). Todos los cebadores tienen una longitud de 20 bp, su temperatura de fusión (Tm) es de 54-58°C y la región amplificada tendrá una longitud de 700-1200 bp.
Antes de cada cebador se añadieron las dos secuencias siguientes para permitir la etapa de clonación específicamente en el plásmido PR-T4P:
Las secuencias de cebadores finales se encargaron a Integrated DNA Technologies, Inc. utilizando su servicio "Custom DNA Oligos".
MATERIALES REQUERIDOS |
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Tubos de plástico (1.5 ml) |
Pestels |
Cloroformo, isopropanol y etanol |
Agua Milli-Q |
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 |
Phusion ADN polimerasa, junto con tampón 5x High Fidelity, mezcla de nucleótidos (dNTPs) y MgCl2 |
Cebadores F and R (Sección 3.1) |
Agarosa y tampón 1x TAE |
Cámara de electroforesis |
Colorante de carga y escalera de ADN de 1 kb |
Transiluminador UV |
Kit SuperScript III (cebador Oligo(dT)20, dNTPs, tampón de primera cadena 5x, DTT, inhibidor de RNAsa y SuperScript III retro transcriptasa) |
Tubos de plástico (0.2 ml) |
Termociclador |
QKit de purificación QIAquick PCR o QIAquick Gel Extraction Kit (cuchilla y termobloque) |
Plásmido PR-T4P |
Enzima de restricción SmaI y 10x NEB tampón #2 |
T4 polimerasa, su tampón y BSA |
Nucleótidos GTP y CTP |
El ARN total para cada especie se purificó de 3-5 gusanos adultos de 5-7 mm de longitud usando TRIzol® (Ambion). Los tejidos se disociaron usando un mortero y luego se siguieron las instrucciones del fabricante. El ARN se disolvió en agua Milli-Q con una concentración de aproximadamente 1 μg/ml y la cantidad y calidad del ARN se evaluó con el espectrofotómetro NanoDrop 1000
Se usó ARN total purificado (1-2 μg) como molde durante la reacción de retrotranscripción con la enzima transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) que sintetiza ADNc (ADN complementario al molde de ARN). Siguiendo las instrucciones del fabricante, se obtuvieron 20 μl de ADNc y luego se almacenaron a -20°C.
Se realizó una reacción de PCR por cada par de cebadores con 1 μl de ADNc como molde y la enzima Phusion ADN polimerasa (New England Biolabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. El siguiente programa de PCR de toma de contacto se utilizó para todos los pares de cebadores informados (Tabla 2-5):
Una pequeña fracción del ADN amplificado (1-2 μl) se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en 1x tampón TAE. Si se obtuvo una sola banda del tamaño adecuado, la fracción residual (17-19 μl) se purificó con el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Si estaban presentes múltiples bandas, la fracción residual (17-19 μl) se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en un tampón TAE 1x y la banda con el tamaño esperado se cortó específicamente del gel usando una cuchilla y se purificó con el QIAquick Gel Kit de extracción (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En ambos casos, la cantidad y calidad del ADN amplificado y purificado se analizaron con el espectrofotómetro NanoDrop 1000.
El plásmido PR-T4P (Adler et al., 2014; Rink et al., 2009) se digirió durante la noche (ON) con la enzima de restricción SmaI, se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1x y el plásmido abierto se purificó a partir de el gel con el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Tanto el plásmido como el fragmento se trataron por separado con ADN polimerasa T4 y nucleótidos de GTP o nucleótidos de CTP, respectivamente (como se describe por el fabricante) para crear extremos adhesivos específicos y complementarios. Las reacciones se incubaron durante 30 min a 22°C y durante 20 min a 75°C.
Este tratamiento de plásmidos y fragmentos permite una ligadura direccional, lo que significa que el fragmento se une al plásmido solo en la dirección prevista y no al revés.
La ligadura ocurrió mezclando 2 μl del fragmento con 1 μl del plásmido PR-T4P e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
Los constructos obtenidos (el fragmento unido al plásmido) se almacenaron a -20°C.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Escherichia coli DH5α competente |
Baño de agua o termobloque |
Caldo Luria (LB) |
Incubadora a 37°C y agitador |
LB-Kan (50 µg/ml) placa y LB-Kan (50 µg/ml) caldo |
Paso opcional: Termociclador, tubo de plástico (0.2 ml), Taq DNA polimerasa, tampón Taq, dNTPs mix y MgCl2, agarosa y tampón 1x TAE, cámara de electroforesis, tinte de carga y escalera de ADN de 1 kb, transiluminador UV |
Cebadores AA18 y PR244 |
Tubo de plástico (5 or 15 ml) |
Kit QIAprep® Spin Miniprep |
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 |
Computador portátil y conexión a Internet |
Manteniendo el constructo(3 μl) en hielo, se le añadieron 48 μl de una cepa competente de Escherichia coli DH5α. La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo, y luego se realizó un choque térmico durante 35 segundos a 42°C, después de lo cual el tubo se movió de vuelta al hielo. Después de 5 minutos, la E. coli transformada se colocó a temperatura ambiente y se añadieron 1 ml de Caldo Luria (LB) sin antibióticos. Las células se colocaron en un agitador a 250 rpm durante 1 hora a 37ºC para su recuperación y, finalmente, 200 μl de ellas se extendieron en una placa LB-kanamicina (Kan, 50 μg / ml) que posteriormente se incubó ON a 37ºC.
Solo las bacterias transformadas con un plásmido que contiene el inserto son resistentes a la Kanamicina (Kan) y pueden formar una colonia en la placa.
Paso opcional: para verificar dos veces la presencia del constructo dentro de la bacteria, se realizó una prueba de colonias mediante PCR. De cada placa, se seleccionaron 3-5 colonias, se recogieron y se usaron tanto para el cribado de colonias por PCR como para el cultivo de caldo LB-Kan (50 μg/ml) de 5 ml. La PCR se constituyó a partir del plásmido transformado dentro de las bacterias como molde, la ADN polimerasa Taq y dos cebadores (AA18: 5'-CCACCGGTTCCATGGCTAGC-3 'y PR244: 5'-CACATAACCCCTTGGGGCCT-3') que se unen a la secuencia del plásmido en los dos lados del inserto, en la proporción sugerida por el fabricante. El programa de PCR utilizado fue:
La mitad de la reacción de amplificación (10 μl) se realizó en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1x para distinguir las colonias positivas (una señal con el tamaño del inserto) de las negativas (sin banda).
Si no se ejecutó el cribado de colonias, se seleccionaron 2-3 colonias de la placa, se recogieron y se usaron solo para 5 ml de caldo de cultivo LB-Kan (50 μg / ml), que se incubaron en un agitador a 250 rpm y en 37 ° C. La construcción de inserto de plásmido contenida en las bacterias cultivadas durante la noche se purificó usando el kit QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad y calidad del plásmido eluído se evaluaron con el espectrofotómetro NanoDrop 1000.
Una alícuota del constructo, junto con el cebador AA18, se envió a la secuenciación. Las instrucciones para preparar la muestra y enviarla siempre se detallan en el sitio web de la empresa que ofrece el servicio de secuenciación.
La salida de secuenciación se usa para verificar que el gen correcto fue clonado.
Por favor, consulta el tutorial proporcionado "Búsqueda de genes de planarias basado en similitud de secuencia" y utiliza la herramienta disponible "Búsqueda de similitud de secuencia" para comparar la secuencia de ARNm que se encuentra en la Sección 3.1 con el resultado de la secuenciación (fragmento clonado). Si la secuencia correcta se clonó en el plásmido, el constructo se puede usar para la síntesis de ribosonda.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Termociclador y tubo de plástico (0.2 ml) |
Phusion DNA polimerasa, junto con tampón 5x High Fidelity, dNTPs mix MgCl2) |
Cebadores AA18 y PR244 |
Agarosa y 1x tampón TAE |
Cámara de electroforesis |
Colorante de carga y escalera de ADN de 1kb |
Transiluminador UV |
Kit de purificación de PCR QIAquick |
Espectrofotómetro NanoDrop 1000 |
Termobloque |
T7 ARN polimerasa y el tampón optimizado para la transcripción |
DIG-nucleótidos |
Inhibidor de RNasa |
Agua Milli-Q |
RQ1 DNasa libre de RNasa |
7.5 M de amonio acetato |
Etanol 100% y 70% |
Glucógeno |
Formamida desionizada |
Una vez que el gen de interés se clonó con éxito (Sección 3.3), se obtuvieron 0.8-1 μg de inserto amplificado por PCR, usando 10 ng del constructo como plantilla, el cebador AA18 y PR244 y la enzima Phusion DNA polimerasa (New England Biolabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para obtener la cantidad requerida de secuencia de inserción amplificada, se preparan 160 μl (4 reacciones/40 μl de cada una) de PCR con 100 ng de plantilla por cada reacción. Se utiliza el programa de PCR de ensayo reportado en la Sección 3.2.
Se ejecuta una pequeña alícuota del ADN amplificado resultante (1-2 μl) en gel de agarosa al 1% en TAE 1x para comprobar si la reacción funcionó correctamente. La alícuota residual (157-159 μl) se purificó con el kit de purificación de PCR de QIAquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante, y la cantidad y calidad del ADN amplificado y purificado se analizan con un espectrofotómetro tal como el NanoDrop 1000.
Este ADN amplificado y purificado representa la plantilla para la reacción de síntesis de ribosonda. La reacción de síntesis de ribosonda consiste en la incubación nocturna (ON) (aproximadamente 16 horas) a 37°C de 0,8-1 μg del producto de PCR purificado, T7 ARN polimerasa (Promega), el tampón optimizado para transcripción (Promega), Digoxigenina (DIG)-nucleótidos (Roche) e inhibidor de RNasa (Promega) en agua Milli-Q después de la dilución sugerida por el fabricante. Los nucleótidos que constituyen las ribosondas están marcados con DIG, para poder detectar la localización de la ribosonda con Ab anti-DIG.
Al día siguiente, se purifica la ribosonda sintetizada:
Se ejecuta una pequeña alícuota de la ribosonda sintetizada y purificada (4 μl) en gel de agarosa al 1% en TAE 1x para comprobar si los pasos de síntesis y purificación funcionaban correctamente. Podría suceder que la banda no esté bien definida o exactamente en el tamaño esperado debido a las diferentes propiedades de migración del ARN en comparación con el ADN.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Tubos de plástico (1.5 ml) |
Instant Ocean® sal marina o agua Montjuïc 1x |
PBS (Fórmulas para solución) |
N-acetilcisteína |
Paraformaldehído |
Triton X-100 y Tween-20 |
Metanol 50% y 100% |
Ribosondas (Sección 3.4) |
Hybe (Fórmulas para solución) |
WashHybe (Fórmulas para solución) |
2x and 0.2x SSC (Fórmulas para solución) |
MABT (Fórmulas para solución) |
Solución bloqueadora (Fórmulas para solución) |
Filtro de jeringa de 0.45 μm de tamaño de poro y jeringas |
Opcional: Cestas y 24 platos multipocillo y parafilm |
Papel de filtro o unidad de filtro para filtrar las soluciones |
Solución de blanqueador de formamida o metanol (Fórmulas para solución) |
Proteinasa K (Fórmulas para solución) |
PreHybe (Fórmulas para solución) |
Incubator a 56°C |
Anticuerpo anti-DIG-AP conjugado |
Tampón AP, EQ y DEV (Fórmulas para solución) |
Alambre de tungsteno o fórceps |
Etanol 50% y 100% |
Glicerol o ScaleA2 80% (Fórmulas para solución) |
Portaobjetos, cubreobjetos y espaciadores |
El protocolo WISH se aplica para visualizar el objetivo de ARNm, es decir, donde se localizan las células que expresan el gen de interés. Los datos de WISH son principalmente cualitativos, pero es posible obtener una indicación sobre la abundancia de ARNm en los diferentes tejidos de planarias. Debido a que la especificidad de la unión de la ribosonda es fundamental, tanto la secuencia de la ribosonda, las condiciones de hibridación y los lavados rigurosos son igual y fundamentalmente importantes. El siguiente protocolo requiere de 4 días:
Día 1: Fijación animal
Día 2: Incubación con las ribosondas
OPCIÓN DE BLANQUEAMIENTO A) La mayoría de los gusanos y sondas funcionan bien con una solución de blanqueamiento de formamida.
OPCIÓN DE BLANQUEAMIENTO B) Algunas reacciones requieren la solución de blanqueador de metanol en lugar de la solución de blanqueador de formamida porque este último es menos suave y causa el aflojamiento del epitelio y la estructura superficial.
Nota: El paso de blanqueamiento A se usó en Girardia sp. para frz-like, PC2, laminin-like, innexin-10, genes de colágeno; en D. dorotocephala para slit-1, sfrp-1, genes frz-like; en P. morgani para todas las ribosondas y en P. gracilis para todas las ribosondas. El paso de blanqueamiento B se usó en Girardia sp. para los genes piwi-1, ifb, slit-1, sfrp-1, opsin-like, porcupine-like y en D. dorotocephala para piwi-1, ifb, PC2, opsin-like, porcupine-like, laminin-like, innexin-10, genes de colágeno.
Después del paso de blanqueamiento A) o B):
Nota: Todas las sondas utilizadas en el documento "Práctica, estudios en el aula de regeneración y biología de células madre utilizando planarias de agua dulce" se diluyeron 1: 1000, excepto para detectar la expresión del gen de colágeno en D. dorotocephala y P. morgani, donde las ribosondas fueron diluidas 1:500.
Día 3: Eliminación del exceso de ribosonda e incubación con el anticuerpo
Día 4: Desarrollo de la señal
Tabla 2: Cebador para el protocolo WISH en Girardia sp.
Nombre del gen | Secuencia del cebador F | Secuencia del cebador R | Longitud de secuencia |
---|---|---|---|
piwi-1 | GCAAAGATGGTAGAGTCGTC | CGATTATGCTCTTGAACTCC | 3975 |
pc2 | CTGCAGTAAAACTGCTATCG | GCAAGATCGTATTCCACTTC | 1680 |
opsin-like | GCCTATTTCAGTGCTCATTC | CTTTAGTTGGTTTGGGACAG | 1329 |
porcupine-like | GGCCGGAATTGTAGAGTAAG | AGAAAGCTAGTGGTTCGATG | 1480 |
laminin-like | GGTAAATATGGGTGTTCCG | TTTGGTTTCACAGGAGAGTC | 3189 |
innexin | GAATGGAAGACTTTGCAGAC | GTTGTAATCAAATCACCCGC | 1078 |
collagen | AGGAAAACAAGGACCTGAAG | CCTAAAGGACCATTTGAACC | 1002 |
ifb | GTGTGAGTTGCCTTTTCTTC | ACTACAGGAAACCAGAATGC | 1697 |
slit | CAATATATCTCCACATCCCG | TACCAGATGGACTGTTTTCC | 3692 |
sfrp-1 | ATAGGCAGCATATCGTTCTC | TATCAGACACCACCAAACAC | 1005 |
frizzled-like | AGACTCCGAGATTACAATGC | ATACTCGACCAATTAACCCC | 1343 |
Tabla 3: Cebador para protocolo WISH en Dugesia dorotocephala
Nombre del gen | Secuencia del cebador F | Secuencia del cebador R | Longitud de secuencia |
---|---|---|---|
piwi-1 | GCGAGGAGTACTACCAAATG | ACGGCTACAAGTAGAACAGG | 2049 |
pc2 | ACAACTTGATTGTCGAGGAC | TGTAAAACAAGGACCCACTC | 2129 |
opsin-like | CACTTTCGTAAGCCTCATTC | CGTTCATCCTTACTGGAGAG | 1139 |
porcupine-like | ATAATCGGCCTGAATCGTAG | AGGAGTAGAGTGGTTCGATG | 1489 |
laminin-like | TTGTTCCCATAAGACCACTC | CGAATAGGTCGAATAGTTGG | 3362 |
innexin | CTTCGTCTACGGTTTATTCG | GCGCATTGAGCTAAGTAATC | 1007 |
collagen | GACCTCAAGGAATAGCTGGT | CCATGTCGGACCATTAAGTA | 1001 |
ifb | GGATCACATCTGATAAACCG | ATAAAGTGCGACATCTGGAG | 1526 |
slit | TTTACAGCTTCGAGGAAGAG | AAAACACCTGTCAACCAGAC | 3812 |
sfrp-1 | ATCGTTCCTGGAGACTTATG | TTGGTATTCGGGGAATG | 903 |
frizzled-like | ACAACACGAAAGAGAGATGC | ATGTTCTCCGATTACCGAG | 1949 |
Tabla 4: Cebador para protocolo WISH en Phagocata morgani
Nombre del gen | Secuencia del cebador F | Secuencia del cebador R | Longitud de secuencia |
---|---|---|---|
piwi-1 | CCGGGATTAGGATTATTACC | ACCTTCACTTCAACCTGATG | 1999 |
pc2 | AGGAATTACAACGCAGAGAG | ATCGAACATGACGGTTAGTC | 1203 |
opsin-like | AGCTCTGTCGATGAAGAAAG | ATCGAAGTAGGATTGGTGG | 312 |
tnxb | TGTCTGTGCAAAAGATTCCT | CCGCCACAATTATTACACAT | 803 |
laminin-like | ATACACGTGTGAGGGTATCG | TCATGACAACTATTGGTCCC | 479 |
innexin | CATGTCTCAAATCACTGTGC | AAGTTGTCCAAGTATGTGGG | 1414 |
collagen | CTCGAATAAGCAAACCACAG | GTTGGTGATCTCATTTGCAT | 1300 |
ifb | ATGCTGCATAGAGTCCAGTC | GTCGGAGGTCAAAGTGTTAC | 813 |
slit | GTCAAGTGCGTAGGTAGAGG | TATGCAGTCTTCGTCATGTG | 636 |
sfrp-1 | AAATCGCTTGCTTCCTG | CGTGAAGCAGGATAAAACTG | 1005 |
frizzled-like | GCAGTTGGACTTTTTAGTGG | ATGCTTACTGGATACTTCGC | 988 |
Tabla 5: Cebador para protocolo WISH en Phagocata gracilis
Nombre del gen | Secuencia del cebador F | Secuencia del cebador R | Longitud de secuencia |
---|---|---|---|
piwi-1 | GTACCTTTAGTGGTTCGCTG | ATGGAGGAGAGAAAGGTAGC | 2135 |
pc2 | GTGAGTGCCGTACCTAGTTG | ACCATTATGTCATAGGGTCG | 1758 |
opsin-like | AGTTGTCTCACGTTCCTTTG | AACTCCACCGTTAATGTGTC | 1056 |
porcupine-like | TTACGGTGGTTCTACCATTC | GTTTTAACAGCAGACGTTCC | 1436 |
laminin-like | ATGACCAACACTCTCTCCAG | CAGGTCAAATGAGGATAAGG | 2950 |
innexin | ATGGTCTATCTCACCGTGTC | ACGTTACGACCTACAAATGG | 1306 |
collagen | AGGAGATCCAGGAGAGACTG | GTCGGGTTTATTGGGATAAC | 1300 |
ifb | GACGATTCTTCCGTTATCAG | ATGTAGTCATCAACCGAACC | 1562 |
slit | CCTCCTCAAAGACAGACAAG | AACATCAGCCTCAAGTCATC | 3731 |
sfrp-1 | CATATCTCTTGCTTCCTTGG | CCAGTTTTCTGGCCTAATTC | 578 |
frizzled-like | GGATGAAAACGTAGTCAAGG | GTCTGAGAAAGGATCGAATG | 2023 |
Adler, C.E., Seidel, C.W., McKinney, S.A. & Sánchez Alvarado, A. (2014). Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. eLife, 3, e02238.
Rink, J.C., Gurley, K.A., Elliott, S.A. & Sánchez Alvarado, A. (2009). Planarian Hh signaling regulates regeneration polarity and links Hh pathway evolution to cilia. Science, 326, 1406-1410.