Protocol 3: Whole mount in situ hybridization (WISH)

3.1: Identificación de secuencias específicas de ARNm y diseño de cebador

3.2: Producción de ADNc y clonación de genes

3.3: Transformación y secuencia de inserto

3.4: Síntesis de Ribosondas

3.5: Protocolo WISH

Fórmulas de solución

Tablas

Referencias

 

---

---

El protocolo WISH es probablemente el experimento más complejo sugerido debido a los muchos pasos y reactivos requeridos. El objetivo de este experimento es mostrar dónde se expresa un gen de interés visualizando su ARNm con una ribosonda capaz de reconocerlo específicamente. El estudiante más valiente y curioso puede explorar el patrón de expresión de genes diferentes de los propuestos si quisiera buscar la secuencia de ARNm, clonarla y producir las ribosondas específicas.

Por otro lado, los estudiantes de cualquier nivel pueden mirar las figuras publicadas en el documento "Práctica, estudios de aula de regeneración y biología de células madre usando planarias de agua dulce" y tratar de diseccionar con el docente los pasos del protocolo.

 

3.1: Identificación de secuencias de ARNm de especies específicas y diseño de cebadores

MATERIALES REQUERIDOS
Conexión a Internet
Computadora

Este protocolo WISH es bastante específico y reduce significativamente el riesgo de unión no específica de las ribosondas o de la señal de fondo. En consecuencia, preparamos ribosondas específicas para cada especie de planaria considerada. Para lograr esto, el primer paso es encontrar la secuencia de ARNm del gen de interés, descargarla y diseñar los cebadores específicos.

Entre las herramientas disponibles en este sitio web, la búsqueda de secuencias de ARNm de cuatro especies planarias se proporciona con los tutoriales respectivos.

Si conoces el nombre o la función del gen de interés, consulta el tutorial "Buscar genes planarios basados en el nombre o la función del gen" y utiliza la herramienta "Buscar genes". La herramienta "Búsqueda de similitud en la secuencia" te permite buscar las secuencias planarias que son muy similares a una secuencia ya identificada y disponible en otra especie de planaria (como Schmidtea meditteranea) o en un animal diferente (como el humano Homo sapiens o el ratón Mus musculus). Para aprender a usar esta herramienta, consulta los tutoriales "Buscar genes de planarias basados en la homología de proteínas" y "Buscar genes de planarias basados en la similitud de secuencias".

Una vez que se obtuvo una secuencia de ARNm para cada gen de interés para cada especie de planaria, se diseñaron los cebadores específicos. El tutorial "Diseño de cebador específico para una secuencia de interés" explica cómo explotar correctamente la herramienta "Diseño de cebador" que está disponible cada vez que se encuentra una secuencia de interés.

Se diseñaron un cebador directo (F) y un cebador inverso (R) para cada secuencia de interés para el protocolo de hibridación in situ, identificado en Girardia sp. (Tabla 2) D. dorotocephala (Tabla 3), P. morgani (Tabla 4) y P. gracilis (Tabla 5). Todos los cebadores tienen una longitud de 20 bp, su temperatura de fusión (Tm) es de 54-58°C y la región amplificada tendrá una longitud de 700-1200 bp.

Antes de cada cebador se añadieron las dos secuencias siguientes para permitir la etapa de clonación específicamente en el plásmido PR-T4P:

• 5’-CATTACCATCCCG + secuencia Cebador F-3’
• 5’-CCAATTCTACCCG + secuencia Cebador R-3’

Las secuencias de cebadores finales se encargaron a Integrated DNA Technologies, Inc. utilizando su servicio "Custom DNA Oligos".

volver arriba

---

 

3.2: Producción de ADNc y clonación de genes

MATERIALES REQUERIDOS
Tubos de plástico (1.5 ml)
Pestels
Cloroformo, isopropanol y etanol
Agua Milli-Q
Espectrofotómetro NanoDrop 1000
Phusion ADN polimerasa, junto con tampón 5x High Fidelity, mezcla de nucleótidos (dNTPs) y MgCl2
Cebadores F and R (Sección 3.1)
Agarosa y tampón 1x TAE
Cámara de electroforesis
Colorante de carga y escalera de ADN de 1 kb
Transiluminador UV
Kit SuperScript III (cebador Oligo(dT)20, dNTPs, tampón de primera cadena 5x, DTT, inhibidor de RNAsa y SuperScript III retro transcriptasa)
Tubos de plástico (0.2 ml)
Termociclador
QKit de purificación QIAquick PCR o QIAquick Gel Extraction Kit (cuchilla y termobloque)
Plásmido PR-T4P
Enzima de restricción SmaI y 10x NEB tampón #2
T4 polimerasa, su tampón y BSA
Nucleótidos GTP y CTP

El ARN total para cada especie se purificó de 3-5 gusanos adultos de 5-7 mm de longitud usando TRIzol® (Ambion). Los tejidos se disociaron usando un mortero y luego se siguieron las instrucciones del fabricante. El ARN se disolvió en agua Milli-Q con una concentración de aproximadamente 1 μg/ml y la cantidad y calidad del ARN se evaluó con el espectrofotómetro NanoDrop 1000

Se usó ARN total purificado (1-2 μg) como molde durante la reacción de retrotranscripción con la enzima transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) que sintetiza ADNc (ADN complementario al molde de ARN). Siguiendo las instrucciones del fabricante, se obtuvieron 20 μl de ADNc y luego se almacenaron a -20°C.

Se realizó una reacción de PCR por cada par de cebadores con 1 μl de ADNc como molde y la enzima Phusion ADN polimerasa (New England Biolabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. El siguiente programa de PCR de toma de contacto se utilizó para todos los pares de cebadores informados (Tabla 2-5):

•  1 ciclo: 2 minutos a 98°C
•  8 ciclos: 30 segundos a 98°C, 30 segundos de 65°C a 58°C (la Tm disminuye 1°C en cada ciclo), 90 minutos a 72°C
•  32 ciclos: 30 segundos a 98°C, 30 segundos a 58°C, 90 segundos a 72°C
•  1 ciclo: 5 minutos a 72°C.

Una pequeña fracción del ADN amplificado (1-2 μl) se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en 1x tampón TAE. Si se obtuvo una sola banda del tamaño adecuado, la fracción residual (17-19 μl) se purificó con el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Si estaban presentes múltiples bandas, la fracción residual (17-19 μl) se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en un tampón TAE 1x y la banda con el tamaño esperado se cortó específicamente del gel usando una cuchilla y se purificó con el QIAquick Gel Kit de extracción (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En ambos casos, la cantidad y calidad del ADN amplificado y purificado se analizaron con el espectrofotómetro NanoDrop 1000.

El plásmido PR-T4P (Adler et al., 2014; Rink et al., 2009) se digirió durante la noche (ON) con la enzima de restricción SmaI, se ejecutó en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1x y el plásmido abierto se purificó a partir de el gel con el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Tanto el plásmido como el fragmento se trataron por separado con ADN polimerasa T4 y nucleótidos de GTP o nucleótidos de CTP, respectivamente (como se describe por el fabricante) para crear extremos adhesivos específicos y complementarios. Las reacciones se incubaron durante 30 min a 22°C y durante 20 min a 75°C.

Este tratamiento de plásmidos y fragmentos permite una ligadura direccional, lo que significa que el fragmento se une al plásmido solo en la dirección prevista y no al revés.

La ligadura ocurrió mezclando 2 μl del fragmento con 1 μl del plásmido PR-T4P e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).

Los constructos obtenidos (el fragmento unido al plásmido) se almacenaron a -20°C.

 

volver arriba

---

 

3.3: Secuencia de inserción y transformación

MATERIALES REQUERIDOS
Escherichia coli DH5α competente
Baño de agua o termobloque
Caldo Luria (LB)
Incubadora a 37°C y agitador
LB-Kan (50 µg/ml) placa y LB-Kan (50 µg/ml) caldo
Paso opcional: Termociclador, tubo de plástico (0.2 ml), Taq DNA polimerasa, tampón Taq, dNTPs mix y MgCl2, agarosa y tampón 1x TAE, cámara de electroforesis, tinte de carga y escalera de ADN de 1 kb, transiluminador UV
Cebadores AA18 y PR244
Tubo de plástico (5 or 15 ml)
Kit QIAprep® Spin Miniprep
Espectrofotómetro NanoDrop 1000
Computador portátil y conexión a Internet

Manteniendo el constructo(3 μl) en hielo, se le añadieron 48 μl de una cepa competente de Escherichia coli DH5α. La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo, y luego se realizó un choque térmico durante 35 segundos a 42°C, después de lo cual el tubo se movió de vuelta al hielo. Después de 5 minutos, la E. coli transformada se colocó a temperatura ambiente y se añadieron 1 ml de Caldo Luria (LB) sin antibióticos. Las células se colocaron en un agitador a 250 rpm durante 1 hora a 37ºC para su recuperación y, finalmente, 200 μl de ellas se extendieron en una placa LB-kanamicina (Kan, 50 μg / ml) que posteriormente se incubó ON a 37ºC.

Solo las bacterias transformadas con un plásmido que contiene el inserto son resistentes a la Kanamicina (Kan) y pueden formar una colonia en la placa.

Paso opcional: para verificar dos veces la presencia del constructo dentro de la bacteria, se realizó una prueba de colonias mediante PCR. De cada placa, se seleccionaron 3-5 colonias, se recogieron y se usaron tanto para el cribado de colonias por PCR como para el cultivo de caldo LB-Kan (50 μg/ml) de 5 ml. La PCR se constituyó a partir del plásmido transformado dentro de las bacterias como molde, la ADN polimerasa Taq y dos cebadores (AA18: 5'-CCACCGGTTCCATGGCTAGC-3 'y PR244: 5'-CACATAACCCCTTGGGGCCT-3') que se unen a la secuencia del plásmido en los dos lados del inserto, en la proporción sugerida por el fabricante. El programa de PCR utilizado fue:

•   1 ciclo: 5 minutos a 95°C
•   35 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 58°C, 120 segundos a 72°C
•   1 ciclo: 5 minutos a 72°C.

La mitad de la reacción de amplificación (10 μl) se realizó en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE 1x para distinguir las colonias positivas (una señal con el tamaño del inserto) de las negativas (sin banda).

Si no se ejecutó el cribado de colonias, se seleccionaron 2-3 colonias de la placa, se recogieron y se usaron solo para 5 ml de caldo de cultivo LB-Kan (50 μg / ml), que se incubaron en un agitador a 250 rpm y en 37 ° C. La construcción de inserto de plásmido contenida en las bacterias cultivadas durante la noche se purificó usando el kit QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad y calidad del plásmido eluído se evaluaron con el espectrofotómetro NanoDrop 1000.

Una alícuota del constructo, junto con el cebador AA18, se envió a la secuenciación. Las instrucciones para preparar la muestra y enviarla siempre se detallan en el sitio web de la empresa que ofrece el servicio de secuenciación.

La salida de secuenciación se usa para verificar que el gen correcto fue clonado.

Por favor, consulta el tutorial proporcionado "Búsqueda de genes de planarias basado en similitud de secuencia" y utiliza la herramienta disponible "Búsqueda de similitud de secuencia" para comparar la secuencia de ARNm que se encuentra en la Sección 3.1 con el resultado de la secuenciación (fragmento clonado). Si la secuencia correcta se clonó en el plásmido, el constructo se puede usar para la síntesis de ribosonda.

volver arriba

---

 

3.4: Síntesis de ribosonda

MATERIALES REQUERIDOS
Termociclador y tubo de plástico (0.2 ml)
Phusion DNA polimerasa, junto con tampón 5x High Fidelity, dNTPs mix MgCl2)
Cebadores AA18 y PR244
Agarosa y 1x tampón TAE
Cámara de electroforesis
Colorante de carga y escalera de ADN de 1kb
Transiluminador UV
Kit de purificación de PCR QIAquick
Espectrofotómetro NanoDrop 1000
Termobloque
T7 ARN polimerasa y el tampón optimizado para la transcripción
DIG-nucleótidos
Inhibidor de RNasa
Agua Milli-Q
RQ1 DNasa libre de RNasa
7.5 M de amonio acetato
Etanol 100% y 70%
Glucógeno
Formamida desionizada

Una vez que el gen de interés se clonó con éxito (Sección 3.3), se obtuvieron 0.8-1 μg de inserto amplificado por PCR, usando 10 ng del constructo como plantilla, el cebador AA18 y PR244 y la enzima Phusion DNA polimerasa (New England Biolabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para obtener la cantidad requerida de secuencia de inserción amplificada, se preparan 160 μl (4 reacciones/40 μl de cada una) de PCR con 100 ng de plantilla por cada reacción. Se utiliza el programa de PCR de ensayo reportado en la Sección 3.2.

Se ejecuta una pequeña alícuota del ADN amplificado resultante (1-2 μl) en gel de agarosa al 1% en TAE 1x para comprobar si la reacción funcionó correctamente. La alícuota residual (157-159 μl) se purificó con el kit de purificación de PCR de QIAquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante, y la cantidad y calidad del ADN amplificado y purificado se analizan con un espectrofotómetro tal como el NanoDrop 1000.

 

Este ADN amplificado y purificado representa la plantilla para la reacción de síntesis de ribosonda. La reacción de síntesis de ribosonda consiste en la incubación nocturna (ON) (aproximadamente 16 horas) a 37°C de 0,8-1 μg del producto de PCR purificado, T7 ARN polimerasa (Promega), el tampón optimizado para transcripción (Promega), Digoxigenina (DIG)-nucleótidos (Roche) e inhibidor de RNasa (Promega) en agua Milli-Q después de la dilución sugerida por el fabricante. Los nucleótidos que constituyen las ribosondas están marcados con DIG, para poder detectar la localización de la ribosonda con Ab anti-DIG.

Al día siguiente, se purifica la ribosonda sintetizada:

1. Agregar a la mezcla 2 μl de RQ1DNasa RQ1 libre de ARNasa e incubar durante 1 hora a 37°C.
2. Agregar 0.5 volúmenes de 7.5 M de amonio acetato y mezclar suavemente
3. Agregar 2 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo.
4. Agregar 2 μl de glucógeno e incubar durante 45 minutos a -20°C.
5. Centrifugar durante 45 minutos a 4°C a velocidad máxima.
6. Retirar el sobrenadante.
7. Resuspender el sedimento en 100 μl de formamida desionizada.
8. Centrifugar por 5 minutos a 4°C a velocidad máxima.
9. Retirar el sobrenadante.
10. Volver a suspender el sedimento en 100 μl de formamida desionizada.
11. Guardar las ribosondas a -20°C o -80°C para almacenamiento a largo plazo.

 

Se ejecuta una pequeña alícuota de la ribosonda sintetizada y purificada (4 μl) en gel de agarosa al 1% en TAE 1x para comprobar si los pasos de síntesis y purificación funcionaban correctamente. Podría suceder que la banda no esté bien definida o exactamente en el tamaño esperado debido a las diferentes propiedades de migración del ARN en comparación con el ADN.

volver arriba

---

 

3.5:WISH

MATERIALES REQUERIDOS
Tubos de plástico (1.5 ml)
Instant Ocean® sal marina o agua Montjuïc 1x
PBS (Fórmulas para solución)
N-acetilcisteína
Paraformaldehído
Triton X-100 y Tween-20
Metanol 50% y 100%
Ribosondas (Sección 3.4)
Hybe (Fórmulas para solución)
WashHybe (Fórmulas para solución)
2x and 0.2x SSC (Fórmulas para solución)
MABT (Fórmulas para solución)
Solución bloqueadora (Fórmulas para solución)
Filtro de jeringa de 0.45 μm de tamaño de poro y jeringas
Opcional: Cestas y 24 platos multipocillo y parafilm
Papel de filtro o unidad de filtro para filtrar las soluciones
Solución de blanqueador de formamida o metanol (Fórmulas para solución)
Proteinasa K (Fórmulas para solución)
PreHybe (Fórmulas para solución)
Incubator a 56°C
Anticuerpo anti-DIG-AP conjugado
Tampón AP, EQ y DEV (Fórmulas para solución)
Alambre de tungsteno o fórceps
Etanol 50% y 100%
Glicerol o ScaleA2 80% (Fórmulas para solución)
Portaobjetos, cubreobjetos y espaciadores

El protocolo WISH se aplica para visualizar el objetivo de ARNm, es decir, donde se localizan las células que expresan el gen de interés. Los datos de WISH son principalmente cualitativos, pero es posible obtener una indicación sobre la abundancia de ARNm en los diferentes tejidos de planarias. Debido a que la especificidad de la unión de la ribosonda es fundamental, tanto la secuencia de la ribosonda, las condiciones de hibridación y los lavados rigurosos son igual y fundamentalmente importantes. El siguiente protocolo requiere de 4 días:

• Día 1: Fijación animal (se matan las planarias y se les elimina la capa de mucosa con N-Acetilcisteína, se fijan con tratamiento de paraformaldehído, luego se permeabilizan los tejidos con Triton X-100 y se deshidratan para su larga conservación en metanol).
• Día 2: Incubación con las ribosondas (las planarias son rehidratadas, blanqueadas para remover el pigmento para ayudar a la visualización de la señal, tratadas con proteinasa K que aumenta la accesibilidad al tejido e incubadas con las ribosondas etiquetadas con DIG y diluidas en el tampón de hibridación).
• Día 3:  Remoción del exceso de ribosonda e incubación con el anticuerpo (las planarias son lavadas a fondo para remover las ribosondas no ligadas o no ligadas específicamente e incubadas con el anticuerpo anti-DIG diluido en solución bloqueadora, lo que disuade la unión de los anticuerpos en lugares no específicos)
• Día 4: Desarrollo de la señal colorimétrica NBT/BCIP (las planarias son lavadas a fondo para eliminar los anticuerpos no ligados o no ligados específicamente, e incubadas en la solución que desarrolla la señal colorimétrica; luego la señal no específica y el fondo son lavados con etanol y los gusanos son fijados para preservarlos para su almacenamiento a largo plazo en glicerol 80% o en ScaleA2 80%)

Día 1: Fijación animal

1. Recolecta de 3 a 5 planarias (de 2 a 5 mm de largo y privadas de alimento durante 1 semana) para cada sonda de interés (el triplicado es importante para compaginar las posibles diferencias entre animales y garantizar la reproducibilidad, robustez y consistencia de los resultados).
2. Transfiere las planarias en tubos de plástico de 1,5 ml (para procesar hasta 20 gusanos).
3. Enjuaga los gusanos dos veces antes de la fijación para eliminar la suciedad.
4. Incuba los gusanos con N-Acetilcisteína al 5% (NAC, reactivo mucolítico que elimina la mucosidad y mata los gusanos) en 1x PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Incuba las muestras en la solución fijadora de paraformaldehído al 4% en 1x PBSTx durante 40 minutos a temperatura ambiente.
6. Enjuaga los gusanos dos veces con 1x PBSTx durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Incuba los gusanos en metanol al 50% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Enjuaga los gusanos con metanol al 100
9. Reemplaza el 100% de metanol e incuba los gusanos durante 10 minutos a temperatura ambiente.
10. Los gusanos ahora están completamente deshidratados y pueden almacenarse en metanol al 100% a -20°C hasta su uso.

Día 2: Incubación con las ribosondas

OPCIÓN DE BLANQUEAMIENTO A) La mayoría de los gusanos y sondas funcionan bien con una solución de blanqueamiento de formamida.

1. Mueve los gusanos en cestas colocadas en una placa de 24 pocillos múltiples (también se puede usar un tubo de plástico de 1,5 ml a través de todo el protocolo)
2. El metanol al 100% utilizado para el almacenamiento a largo plazo se reemplaza por metanol al 50% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Incuba los gusanos con 1x PBSTx durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Enjuaga los gusanos con PBSTx.
5. Incuba los gusanos en una solución de blanqueamiento de formamida durante 1 hora a temperatura ambiente bajo luz directa.
6. Enjuaga los gusanos dos veces con 1x PBSTw.

OPCIÓN DE BLANQUEAMIENTO B) Algunas reacciones requieren la solución de blanqueador de metanol en lugar de la solución de blanqueador de formamida porque este último es menos suave y causa el aflojamiento del epitelio y la estructura superficial.

1. El metanol al 100% utilizado para el almacenamiento a largo plazo se reemplaza por la solución de blanqueador de metanol por un período de tiempo de 12 horas o durante la niche (ON) a temperatura ambiente bajo luz directa.
2. Enjuaga los gusanos dos veces con metanol al 100%.
3. Incuba los gusanos en metanol al 50% por 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Enjuaga los gusanos con 1x PBSTw.
5. Incuba los gusanos con 1x PBSTw durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Nota: El paso de blanqueamiento A se usó en Girardia sp. para frz-like, PC2, laminin-like, innexin-10, genes de colágeno; en D. dorotocephala para slit-1, sfrp-1, genes frz-like; en P. morgani para todas las ribosondas y en P. gracilis para todas las ribosondas. El paso de blanqueamiento B se usó en Girardia sp. para los genes piwi-1, ifb, slit-1, sfrp-1, opsin-like, porcupine-like y en D. dorotocephala para piwi-1, ifb, PC2, opsin-like, porcupine-like, laminin-like, innexin-10, genes de colágeno.

Después del paso de blanqueamiento A) o B):

1. Incuba los gusanos con 2 μg/ml de solución de proteinasa K durante 10 minutos a temperatura ambiente
2. Incuba las muestras en la solución fijadora paraformaldehído al 4% en 1x PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Enjuaga los gusanos 2 veces con 1x PBSTw.
4. Incuba los gusanos en 1:1 1x PBSTw : solución de prehibridación (PreHybe) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Incuba los gusanos en PreHybe por 2 horas a 56°C.
6. Incuba los gusanos en ribosonda 1:1000 (1:500-1:2000) en solución Hybe durnate la noche ON a 56-60°C. Si la incubación se realiza en la placa de 24 pocillos múltiples, se debe evitar la evaporación de la solución de ribosonda sellando la placa con parafilm.

Nota: Todas las sondas utilizadas en el documento "Práctica, estudios en el aula de regeneración y biología de células madre utilizando planarias de agua dulce" se diluyeron 1: 1000, excepto para detectar la expresión del gen de colágeno en D. dorotocephala y P. morgani, donde las ribosondas fueron diluidas 1:500.

 

Día 3: Eliminación del exceso de ribosonda e incubación con el anticuerpo

1. Incuba los gusanos en solución WashHybe dos veces por 30 minutos a 56-60°C.
2. Incuba los gusanos en 1:1 WashHybe : 2x SSC dos veces por 30 minutos a 56-60°C.
3. Incuba los gusanos en 2x SSC tres veces por 30 minutos a 56-60°C.
4. Incuba los gusanos en 0.2x SSC tres veces por 30 minutos a 56-60°C.
5. Incuba los gusanos en MABT tres veces por 10 minutos a temperatura ambiente.
6. Incuba los gusanos in solución bloqueadora filtrada por 2 horas a temperatura ambiente.
7. Incuba con 1:3000 anti-DIG-AP conjugado en solución de bloqueo filtrada durante la noche (ON) a 4°C.

Día 4: Desarrollo de la señal

1. Incuba los gusanos en MABT seis veces por 20 minutos a temperatura ambiente.
2. Incuba los gusanos en tampón AP por 2 minutos a temperatura ambiente.
3. Incuba los gusanos en tampón EQ por 10 minutos a temperatura ambiente y en el sentido deseado, mientras separas los gusanos con un alambre de tungsteno o una pinza para permitir el desarrollo homogéneo de la señal.
4. Incuba los gusanos en tampón DEV a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que la señal esté completamente desarrollada.
5. Detén el desarrollo de la reacción enjuagando los gusanos 3 veces en 1x PBS.
6. Incuba los gusanos en la solución de fijación de paraformaldehído al 4% en 1x PBSTx durante 20 minutos a temperatura ambiente.
7. Incuba los gusanos en etanol al 100% por 45 minutos o hasta que el fondo esté suficientemente despejado a temperatura ambiente.
8. Incuba los gusanos en etanol al 50% en 1x PBS por 5 minutos a temperatura ambiente.
9. Incuba los gusanos en 1x PBS hasta que los gusanos se hundan.
10. Enjuaga los gusanos en 1x PBS dos veces.
11. Incuba los gusanos en los medios de fijación glicerol 80% o ScaleA2 80% para almacenamiento a largo plazo.
12. Monta los gusanos en los portaobjetos: coloca un espaciador (Sigma-Aldrich) en el portaobjetos, llena el orificio del espaciador con los medios de fijación y los gusanos teñidos, coloca el cubreobjetos encima evitando la formación de burbujas debajo del cubreobjetos (los espaciadores son pegajosos en ambos lados y se adhieren fuertemente tanto al portaobjetos como al cubreobjetos).

volver arriba

---

 

Fórmulas para solución

• General Solutions
  • 1x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄ (monobasic), 10 mM Na₂HPO₄ (dibasic) in Milli-Q H₂O. pH to 7.4. Filter.
  • 1x PBSTx: 0.5% Triton X-100 in 1x PBS. Filter.
  • 1x PBSTw: 0.1% Tween-20 in 1x PBS. Filter.
  • 5% NAC: 5% NAC in 1x PBS. Make it fresh.
  • 4% paraformaldehyde: 4% paraformaldehyde in 1x PBSTx. Make it fresh.
  • Formamide bleach solution: 1.2% H₂O₂, 5% formamide in 0.5x SSC. Make it fresh.
  • Methanol bleach solution: 6% H₂O₂ in 100% Methanol. Make it fresh.
  • Proteinase K solution: 0.1% SDS, 2 μg/ml Proteinase K in 1x PBS. Make it fresh.
  • PreHybe: 50% deionized formamide, 5x SSC, 1x Dehardts, 10 μg/ml Heparin, 1% Tween-20, 50 mM DTT, 1 mg/ml Torula Yeast RNA (Sigma) in Milli-Q H₂O. Shake until all the yeast RNA has gone into solution. Store at -20°C.
  • Hybe: 50% deionized formamide, 5x SSC, 1x Dehardts, 100 μg/ml Heparin, 1% Tween-20, 50 mM DTT, 0.25 mg/ml Yeast RNA (Calbiochem), 5% dextran sulfate in Milli-Q H₂O. Shake and warm up the solution at 37°C until all the yeast RNA and the dextran sulfate have gone into solution and it is fully mixed.  Store at -20°C.
  • WashHybe: 50% formamide, 0.5% Tween-20, 5x SSC, 1x Dehardts in H₂O. Store at -20°C.
  • 20x SSC (Saline Sodium Citrate): 3 M NaCl, 300 mM Sodium Citrate, 1% Tween-20 in Milli-Q H₂O.
  •  MABT: 100 mM Maleic Acid, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 in Milli-Q H₂O. pH to 7.5. Filter.
  • Blocking solution: 5% horse serum, 0.5% Roche Western Blocking Reagent in MABT. Filter with syringe filter 0.45 µm pore size. Make it fresh.
  •  10% PVA: 10% PVA in Milli-Q H₂O. Stir with heat but be sure not to let it boil over. Filter.

 

• NBT/BCIP Development Solutions:
  • AP buffer: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20 in Milli-Q H₂O. Make it fresh.
  • EQ buffer: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20, 5% PVA in Milli-Q H₂O. Make it fresh.
  • DEV Buffer: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20 in 10% PVA. Before usage add 80 μl BCIP and 40 μl NBT. Make it fresh.

 

• Soluciones generales
  • 1x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄ (monobásico), 10 mM Na₂HPO₄ (dibásico) en Milli-Q H₂O. pH a 7.4. Filtrar.
  • 1x PBSTx: 0.5% Triton X-100 en 1x PBS. Filtrar.
  • 1x PBSTw: 0.1% Tween-20 en 1x PBS. Filtrar.
  • 5% NAC: 5% NAC en 1x PBS. Prepáralo en el momento.
  • 4% paraformaldehido: 4% paraformaldehido en 1x PBSTx. Prepáralo en el momento.
  • Solución de blanqueamiento de formamida: 1.2% H₂O₂, 5% formamida en 0.5x SSC. Prepárala en el momento.
  • Solución de blanqueamiento de metanol: 6% H₂O₂ en metanol 100%. Prepárala en el momento.
  • Solución de Proteinasa K: 0.1% SDS, 2 μg/ml Proteinasa K en 1x PBS. Prepárala en el momento.
  • PreHybe: 50% de formamida desionizada, 5x SSC, 1x Dehardts, 10 μg / ml Heparin, 1% Tween-20, 50 mM DTT, 1 mg/ml Torula Yeast RNA (Sigma) en Milli-Q H₂O. Agita hasta que todo el ARN de la levadura se haya disuelto. Almacena a -20 ° C.
  • Hybe: 50% de formamida desionizada, 5x SSC, 1x Dehardts, 100 μg/ml de heparina, 1% de Tween-20, 50 mM de DTT, 0,25 mg / ml de levadura RNA (Calbiochem), 5% sulfato de dextrano en Milli-Q H₂O. Agita y calienta la solución a 37°C hasta que todo el ARN de levadura y el sulfato de dextrano se hayan disuelto y esté completamente mezclado. Almacena a -20°C.
  • WashHybe: 50% formamida, 0.5% Tween-20, 5x SSC, 1x Dehardts in H₂O. Almacena a -20°C.
  • 20x SSC (citrato sódico salino): 3 M NaCl, 300 mM citrato de sodio, 1% Tween-20 en Milli-Q H₂O.
  • MABT: 100 mM ácido maleico, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 en Milli-Q H₂O. pH a 7.5. Filtra.
  • Solución bloqueadora: 5% de suero de caballo, 0.5% de reactivo bloqueante Roche Western en MABT. Filtro con filtro de jeringa de 0.45 µm de tamaño de poro. Prepárala al momento.
  • 10% PVA: 10% PVA en Milli-Q H₂O. Revuelve con calor pero asegúrate que no hierva. Filtra.

 

• NBT/BCIP Soluciones de desarrollo:
  • Tampón AP: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20 en Milli-Q H₂O. Prepáralo al momento.
  • Tampón EQ: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20, 5% PVA en Milli-Q H₂O. Prepáralo al momento.
  • Tampón DEV: 0.1 M Tris pH 9.5, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl₂, 0.1% Tween-20 en 10% PVA. Antes de su uso agrega 80 μl BCIP y 40 μl NBT. Prepáralo al momento.

 

• Medios de montaje:
  • 80% glicerol: 80% glicerol, 1 mM EDTA, 10 mM Tris en Milli-Q H₂O. pH a 7.4.
  • 80% ScaleA2: 2 M Urea, 80% glicerol en Milli-Q H₂O.

 

volver arriba

---

 

Tablas

Tabla 2: Cebador para el protocolo WISH en Girardia sp.

Nombre del gen	Secuencia del cebador F	Secuencia del cebador R	Longitud de secuencia
piwi-1	GCAAAGATGGTAGAGTCGTC	CGATTATGCTCTTGAACTCC	3975
pc2	CTGCAGTAAAACTGCTATCG	GCAAGATCGTATTCCACTTC	1680
opsin-like	GCCTATTTCAGTGCTCATTC	CTTTAGTTGGTTTGGGACAG	1329
porcupine-like	GGCCGGAATTGTAGAGTAAG	AGAAAGCTAGTGGTTCGATG	1480
laminin-like	GGTAAATATGGGTGTTCCG	TTTGGTTTCACAGGAGAGTC	3189
innexin	GAATGGAAGACTTTGCAGAC	GTTGTAATCAAATCACCCGC	1078
collagen	AGGAAAACAAGGACCTGAAG	CCTAAAGGACCATTTGAACC	1002
ifb	GTGTGAGTTGCCTTTTCTTC	ACTACAGGAAACCAGAATGC	1697
slit	CAATATATCTCCACATCCCG	TACCAGATGGACTGTTTTCC	3692
sfrp-1	ATAGGCAGCATATCGTTCTC	TATCAGACACCACCAAACAC	1005
frizzled-like	AGACTCCGAGATTACAATGC	ATACTCGACCAATTAACCCC	1343

 

volver arriba

---

 

Tabla 3: Cebador para protocolo WISH en Dugesia dorotocephala

Nombre del gen	Secuencia del cebador F	Secuencia del cebador R	Longitud de secuencia
piwi-1	GCGAGGAGTACTACCAAATG	ACGGCTACAAGTAGAACAGG	2049
pc2	ACAACTTGATTGTCGAGGAC	TGTAAAACAAGGACCCACTC	2129
opsin-like	CACTTTCGTAAGCCTCATTC	CGTTCATCCTTACTGGAGAG	1139
porcupine-like	ATAATCGGCCTGAATCGTAG	AGGAGTAGAGTGGTTCGATG	1489
laminin-like	TTGTTCCCATAAGACCACTC	CGAATAGGTCGAATAGTTGG	3362
innexin	CTTCGTCTACGGTTTATTCG	GCGCATTGAGCTAAGTAATC	1007
collagen	GACCTCAAGGAATAGCTGGT	CCATGTCGGACCATTAAGTA	1001
ifb	GGATCACATCTGATAAACCG	ATAAAGTGCGACATCTGGAG	1526
slit	TTTACAGCTTCGAGGAAGAG	AAAACACCTGTCAACCAGAC	3812
sfrp-1	ATCGTTCCTGGAGACTTATG	TTGGTATTCGGGGAATG	903
frizzled-like	ACAACACGAAAGAGAGATGC	ATGTTCTCCGATTACCGAG	1949

 

volver arriba

---

 

Tabla 4: Cebador para protocolo WISH en Phagocata morgani

Nombre del gen	Secuencia del cebador F	Secuencia del cebador R	Longitud de secuencia
piwi-1	CCGGGATTAGGATTATTACC	ACCTTCACTTCAACCTGATG	1999
pc2	AGGAATTACAACGCAGAGAG	ATCGAACATGACGGTTAGTC	1203
opsin-like	AGCTCTGTCGATGAAGAAAG	ATCGAAGTAGGATTGGTGG	312
tnxb	TGTCTGTGCAAAAGATTCCT	CCGCCACAATTATTACACAT	803
laminin-like	ATACACGTGTGAGGGTATCG	TCATGACAACTATTGGTCCC	479
innexin	CATGTCTCAAATCACTGTGC	AAGTTGTCCAAGTATGTGGG	1414
collagen	CTCGAATAAGCAAACCACAG	GTTGGTGATCTCATTTGCAT	1300
ifb	ATGCTGCATAGAGTCCAGTC	GTCGGAGGTCAAAGTGTTAC	813
slit	GTCAAGTGCGTAGGTAGAGG	TATGCAGTCTTCGTCATGTG	636
sfrp-1	AAATCGCTTGCTTCCTG	CGTGAAGCAGGATAAAACTG	1005
frizzled-like	GCAGTTGGACTTTTTAGTGG	ATGCTTACTGGATACTTCGC	988

volver arriba

---

Tabla 5: Cebador para protocolo WISH en Phagocata gracilis

Nombre del gen	Secuencia del cebador F	Secuencia del cebador R	Longitud de secuencia
piwi-1	GTACCTTTAGTGGTTCGCTG	ATGGAGGAGAGAAAGGTAGC	2135
pc2	GTGAGTGCCGTACCTAGTTG	ACCATTATGTCATAGGGTCG	1758
opsin-like	AGTTGTCTCACGTTCCTTTG	AACTCCACCGTTAATGTGTC	1056
porcupine-like	TTACGGTGGTTCTACCATTC	GTTTTAACAGCAGACGTTCC	1436
laminin-like	ATGACCAACACTCTCTCCAG	CAGGTCAAATGAGGATAAGG	2950
innexin	ATGGTCTATCTCACCGTGTC	ACGTTACGACCTACAAATGG	1306
collagen	AGGAGATCCAGGAGAGACTG	GTCGGGTTTATTGGGATAAC	1300
ifb	GACGATTCTTCCGTTATCAG	ATGTAGTCATCAACCGAACC	1562
slit	CCTCCTCAAAGACAGACAAG	AACATCAGCCTCAAGTCATC	3731
sfrp-1	CATATCTCTTGCTTCCTTGG	CCAGTTTTCTGGCCTAATTC	578
frizzled-like	GGATGAAAACGTAGTCAAGG	GTCTGAGAAAGGATCGAATG	2023

volver arriba

---

 

Referencias

 

Adler, C.E., Seidel, C.W., McKinney, S.A. & Sánchez Alvarado, A. (2014). Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. eLife, 3, e02238.

 

Rink, J.C., Gurley, K.A., Elliott, S.A. & Sánchez Alvarado, A. (2009). Planarian Hh signaling regulates regeneration polarity and links Hh pathway evolution to cilia. Science, 326, 1406-1410.

volver arriba

---