REQUIRED MATERIALS |
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Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc water (fpara almacenamiento a mediano y largo plazo) |
Recipientes de plástico o placas de Petri |
Pipetas Pasteur de plástico |
Las planarias son enviadas por Carolina Biological Supply Company o por Ward Scientific dentro de un contenedor de plástico lleno de agua. Para un mantenimiento a corto plazo (<4 semanas) los gusanos pueden mantenerse en esta agua sin alimentación ni cambios de agua (Tabla 1). Para el almacenamiento a mediano y largo plazo (> 4 semanas) las lombrices pueden mantenerse en 0.5 g/l de Instant Ocean® sal marina (Spectrum Brand) en agua destilada (King y Newmark, 2013) o en agua 1x Montjuïc (1.6 mmol/l NaCl, 1.0 mmol/l CaCl2, 1.0 mmol/l MgSO4, 0.1 mmol/l MgCl2, 0.1 mmol/l KCl y 1.2 mmol/l NaHCO3 en agua Milli-Q, pH 6.9-8.1) (Cebrià y Newmark, 2005) ) (Tabla 1).
Las cuatro especies de planarias se pueden mantener a aproximadamente la temperatura ambiente (RT) (18-22 ° C). Los gusanos pueden alojarse en contenedores de plástico (marca Ziploc®) o en placas de Petri.
Debido a que cada planaria de 6-8 mm requiere 1 ml de agua, podemos colocarlas sobre:
Las planarias pueden transferirse de un recipiente a otro utilizando pipetas Pasteur de plástico con aberturas lo suficientemente grandes como para acomodar los gusanos sin lesionarlos. En caso de que la abertura de la pipeta Pasteur no sea lo suficientemente grande, la punta de la pipeta se puede cortar con tijeras. Una vez que se han asentado los gusanos, las tapas se colocan en los recipientes de almacenamiento o en los platos sin cerrar herméticamente para reducir la evaporación y evitar que los gusanos se escapen. Es importante no sellar completamente los contenedores Ziploc, ya que la falta de oxígeno matará a sus planarias.
Si las planarias no son sanas, muestran lesiones en el lado dorsal de su cuerpo (como se muestra en la Fig. 3 del documento "Práctica, estudios en el aula de regeneración y biología de células madre utilizando planarias de agua dulce"). La eliminación rápida de los individuos enfermos del cultivo reduce el riesgo de perder todos los animales.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Botella exprimible o botella estándar |
Contenedor de basura |
Pipetas de Pasteur plásticas |
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™ |
IInstant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc |
Opcional: placas de Petri nuevas |
El mantenimiento de las planarias a largo plazo requiere cambios de agua dos veces por semana, pero el cultivo se puede mantener durante algunos meses, reemplazando el agua solo una vez por semana (Tabla 1). El agua generalmente se cambia dos días después de la alimentación para eliminar los excrementos.
El protocolo para el cambio de agua es:
Nota: Si hay placas de Petri nuevas disponibles, los gusanos también se pueden colocar en una nueva placa de Petri en lugar de limpiar la sucia.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Hígado de ternera, yema de huevo duro o camarones de agua salada |
Contenedor de basura |
Pipetas de Pasteur plásticas |
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™ |
Instant Ocean® sal mariana o agua 1x Montjuïc |
Opcional: placas de Petri nuevas |
La alimentación es necesaria para el mantenimiento a mediano y largo plazo de las planarias, pero están completamente bien sin alimento durante 3-4 semanas (Tabla 1). Las planarias pueden ser alimentadas con hígado de ternera picado, con yema de huevo duro o con camarón de agua salada, que generalmente se vende como alimento congelado para peces.
Si el hígado de ternera se utiliza para la alimentación, se corta en trozos pequeños (4 x 4 x 4 mm) y se almacena a -20°C. El día de la alimentación:
Los gusanos se pueden alimentar una vez por semana durante 6-7 meses, pero se sugiere un programa de alimentación dos veces por semana si las planarias se mantienen durante un período de tiempo más largo.
Nota: Los gusanos deben pasar hambre de 7 a 10 días antes de cualquier experimento, porque el alimento residual en el intestino ensucia el agua cuando se cortan los animales, interfiere con el tratamiento químico en el protocolo de hibridación in situ (WISH) y reduce la cantidad de comida consumida durante la alimentación de interferencia de ARN.
REQUIRED MATERIALS |
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Etanol |
Cuchilla |
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™ |
Pipetas de Pasteur plásticas |
Placas de Petri |
Botella exprimible o botella estándar y pipetas de Pasteur plásticas |
Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc |
Contenedor de basura |
Todas las especies de planarias reportadas en este documento pueden cortarse en varios fragmentos, y cada fragmento regenerará un organismo completamente nuevo. Esta técnica se usa tanto para aumentar la cantidad de gusanos en su cultivo como para obtener gusanos más pequeños para el protocolo WISH. Los gusanos están listos para ser cortados 48 horas después de la alimentación y se deben seguir los siguientes pasos:
Nota: Girardia sp. y D. dorotocephala se pueden cortar en varios fragmentos diminutos y todos ellos se regeneran; la capacidad regenerativa de P. morgani y P. gracilis es inferior y, en gusanos de tamaño mediano, sugerimos generar 6-7 fragmentos de P. morgani y 10-20 fragmentos de P. gracilis.
Nota: Girardia sp., D. dorotocephala y P. morgani regeneran completamente en 2 semanas, while P. gracilis requieren 4-6 semanas.
La regeneración se completa cuando el animal está adecuadamente proporcionado y la pigmentación del cuerpo es homogénea.
MATERIALES REQUERIDOS |
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Lentes de aumento o microscopio de disección o teléfono inteligente |
Opcional: Cámara |
Pipetas de Pasteur plásticas |
Placas de Petri |
Botella exprimible o botella estándar y Pipetas de Pasteur plásticas |
Cold Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc |
Contenedor de basura |
Las planarias son claramente visibles para el ojo humano cuando son más largas de 1 mm y no se requiere un microscopio durante los cambios de agua y alimentación. Cuando se analizan la salud general, la pigmentación, el comportamiento y la regeneración, se recomienda una resolución más alta. Una lente de aumento o un microscopio de disección junto con una cámara permiten la observación y la documentación de los resultados. Un teléfono inteligente funciona bien si se usa correctamente como se muestra en el video "¡Convierte tu teléfono inteligente en un microscopio digital!" (https://www.youtube.com/watch?v=KpMTkr_aiYU).
Si estás usando un microscopio de disección, la luz debería venir desde arriba de las muestras; el fondo puede ser blanco (para observar gusanos oscuros como P. gracilis o en la regeneración del ojo) o negro (para observar gusanos blancos como P. morgani o en la formación de blastemas y la regeneración de tejidos nuevos). El aumento suele ser de aproximadamente 10x.
Cuando la muestra consiste en planarias vivas, se puede grabar una película para mostrar el movimiento y el comportamiento de los gusanos. Para captar imágenes únicas de gusanos vivos, es necesario reemplazar el agua de planaria por agua fría de planaria inmediatamente antes de la captura de la imagen. El agua fría reduce el movimiento de los gusanos permitiendo la captura de imágenes más claras.
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A largo plazo ( > 28 semanas ) | A mediano plazo ( 4-28 semanas ) | A corto plazo (<4 semanas ) |
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Agua de planaria |
0.5 g/ml Instant Ocean® sal marina en agua o agua 1x Montjuïc |
0.5 g/ml Instant Ocean® sal marina en agua o agua 1x Montjuïc |
Agua de Carolina Supply Biological Company o agua de Ward Scientific |
Cambios de agua |
Dos veces por semana (dos días después de la alimentación) |
Una vez por semana (dos días después de la alimentación) |
Cualquier cambio de agua que sea requerido |
Programa de alimentos |
Dos veces por semana con hígado de ternera, yema de huevo hervida o camarones de agua salada |
Una vez por semana con hígado de ternera, yema de huevo hervida o camarones de agua salada |
Cualquier alimentación que sea requerida |
King, R.S. & Newmark, P.A. (2013). In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology, 13, 8.
Cebrià, F. & Newmark, P.A. (2005). Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development, 132, 3691-3703.