Protocol 1: Planarian maintenance

1.1: Almacenamiento de planarias

1.2: Cambios de agua

1.3: Alimentación de las planarias

1.4: Amplificación de las planarias

1.5: Captura de imágenes de gusanos vivos

Tabla

Referencias

 

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1.1: Almacenamiento de planarias

REQUIRED MATERIALS
Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc water (fpara almacenamiento a mediano y largo plazo)
Recipientes de plástico o placas de Petri
Pipetas Pasteur de plástico

Las planarias son enviadas por Carolina Biological Supply Company o por Ward Scientific dentro de un contenedor de plástico lleno de agua. Para un mantenimiento a corto plazo (<4 semanas) los gusanos pueden mantenerse en esta agua sin alimentación ni cambios de agua (Tabla 1). Para el almacenamiento a mediano y largo plazo (> 4 semanas) las lombrices pueden mantenerse en 0.5 g/l de Instant Ocean® sal marina (Spectrum Brand) en agua destilada (King y Newmark, 2013) o en agua 1x Montjuïc (1.6 mmol/l NaCl, 1.0 mmol/l CaCl₂, 1.0 mmol/l MgSO₄, 0.1 mmol/l MgCl₂, 0.1 mmol/l KCl y 1.2 mmol/l NaHCO₃ en agua Milli-Q, pH 6.9-8.1) (Cebrià y Newmark, 2005) ) (Tabla 1).

Las cuatro especies de planarias se pueden mantener a aproximadamente la temperatura ambiente (RT) (18-22 ° C). Los gusanos pueden alojarse en contenedores de plástico (marca Ziploc®) o en placas de Petri.

Debido a que cada planaria de 6-8 mm requiere 1 ml de agua, podemos colocarlas sobre:

• 5 gusanos en una placa de Petri pequeña (35 x 10 mm, 5 ml)
• 10 gusanos en una placa de Petri mediana (60 x 15 mm, 11 ml)
• 50 gusanos en una placa de Petri grande (100 x 15 mm, 50 ml)
• 100 gusanos en un bol extra pequeño Ziploc^® (9 cm de diámetro x 5 cm de profundidad, 150 ml)
• 500 gusanos en envase cuadrado pequeño Ziploc^® (12 cm x 12 cm x 6 cm, 600 ml)
• 1000 gusanos in envase rectangular grande  Ziploc^® (15 cm x 26 cm x 8 cm, 1300 ml)

 

Las planarias pueden transferirse de un recipiente a otro utilizando pipetas Pasteur de plástico con aberturas lo suficientemente grandes como para acomodar los gusanos sin lesionarlos. En caso de que la abertura de la pipeta Pasteur no sea lo suficientemente grande, la punta de la pipeta se puede cortar con tijeras. Una vez que se han asentado los gusanos, las tapas se colocan en los recipientes de almacenamiento o en los platos sin cerrar herméticamente para reducir la evaporación y evitar que los gusanos se escapen. Es importante no sellar completamente los contenedores Ziploc, ya que la falta de oxígeno matará a sus planarias.

Si las planarias no son sanas, muestran lesiones en el lado dorsal de su cuerpo (como se muestra en la Fig. 3 del documento "Práctica, estudios en el aula de regeneración y biología de células madre utilizando planarias de agua dulce"). La eliminación rápida de los individuos enfermos del cultivo reduce el riesgo de perder todos los animales.

 

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1.2: Cambios de agua

MATERIALES REQUERIDOS
Botella exprimible o botella estándar
Contenedor de basura
Pipetas de Pasteur plásticas
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™
IInstant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc
Opcional: placas de Petri nuevas

El mantenimiento de las planarias a largo plazo requiere cambios de agua dos veces por semana, pero el cultivo se puede mantener durante algunos meses, reemplazando el agua solo una vez por semana (Tabla 1). El agua generalmente se cambia dos días después de la alimentación para eliminar los excrementos.

El protocolo para el cambio de agua es:

1. Llena una botella exprimible de lavado o una botella estándar con agua fresca de planaria
2. Lentamente vierte el agua sucia en un contenedor de basura
3. Usando la botella exprimible de lavado (o una pipeta de transferencia), enjuaga los gusanos, empujándolos a una esquina del contenedor/placa
4. Usa toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™ (KimTech Science) para eliminar el moco del área expuesta dentro del contenedor/placa
5. Expulsa a chorro las planarias a la esquina opuesta del contenedor y repetir el paso 4
6. Llena el recipiente/placa con agua fresca de planaria
7. Examina el contenedor de basura por si algún animal se salió accidentalmente y moverlo de vuelta al contenedor/placa
8. Desecha el agua residual en el fregadero

Nota: Si hay placas de Petri nuevas disponibles, los gusanos también se pueden colocar en una nueva placa de Petri en lugar de limpiar la sucia.

 

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1.3: Alimentación de planarias

MATERIALES REQUERIDOS
Hígado de ternera, yema de huevo duro o camarones de agua salada
Contenedor de basura
Pipetas de Pasteur plásticas
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™
Instant Ocean® sal mariana o agua 1x Montjuïc
Opcional: placas de Petri nuevas

La alimentación es necesaria para el mantenimiento a mediano y largo plazo de las planarias, pero están completamente bien sin alimento durante 3-4 semanas (Tabla 1). Las planarias pueden ser alimentadas con hígado de ternera picado, con yema de huevo duro o con camarón de agua salada, que generalmente se vende como alimento congelado para peces.

Si el hígado de ternera se utiliza para la alimentación, se corta en trozos pequeños (4 x 4 x 4 mm) y se almacena a -20°C. El día de la alimentación:

1. Retira el hígado del congelador y descongélalo
2. Los contenedores grandes reciben cinco pedazos de hígado; los contenedores medianos reciben dos pedazos de hígado; los pequeños recipientes y placas reciben una porción de hígado. Los animales comen el alimento solo si se encuentra en el fondo del recipiente/placa.
3. Controla el comportamiento de alimentación de los gusanos.
4. Deja a los gusanos sin tocar con el alimento hasta que terminen de comer o ya no estén interesados en él. La alimentación dura entre 20 minutos y 2 horas.
5. Elimina cualquier alimento residual con una pipeta.
6. Cambia el agua y limpia la parte inferior de la caja o reemplaza la placa de Petri como se describe en la Sección 1.2.
7. Dos días después de la alimentación, cambia el agua y limpia la parte inferior de la caja o reemplaza la placa de Petri como se describe en la Sección 1.2, para eliminar los excrementos y mantener el cultivo limpio.

Los gusanos se pueden alimentar una vez por semana durante 6-7 meses, pero se sugiere un programa de alimentación dos veces por semana si las planarias se mantienen durante un período de tiempo más largo.

Nota: Los gusanos deben pasar hambre de 7 a 10 días antes de cualquier experimento, porque el alimento residual en el intestino ensucia el agua cuando se cortan los animales, interfiere con el tratamiento químico en el protocolo de hibridación in situ (WISH) y reduce la cantidad de comida consumida durante la alimentación de interferencia de ARN.

 

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1.4: Planarian amplification

REQUIRED MATERIALS
Etanol
Cuchilla
Toallas de papel o limpiador de laboratorio KimWipes™
Pipetas de Pasteur plásticas
Placas de Petri
Botella exprimible o botella estándar y pipetas de Pasteur plásticas
Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc
Contenedor de basura

Todas las especies de planarias reportadas en este documento pueden cortarse en varios fragmentos, y cada fragmento regenerará un organismo completamente nuevo. Esta técnica se usa tanto para aumentar la cantidad de gusanos en su cultivo como para obtener gusanos más pequeños para el protocolo WISH. Los gusanos están listos para ser cortados 48 horas después de la alimentación y se deben seguir los siguientes pasos:

1. Limpia la cuchilla con etanol.
2. Mueve los animales a una placa de Petri llena de agua fresca de planaria.
3. Corta los animales en la cantidad deseada de fragmentos, limpia la cuchilla con frecuencia con una toalla de papel fresca o un KimWipe ™ (KimTech Science) para eliminar la mucosa

Nota: Girardia sp. y D. dorotocephala se pueden cortar en varios fragmentos diminutos y todos ellos se regeneran; la capacidad regenerativa de P. morgani y P. gracilis es inferior y, en gusanos de tamaño mediano, sugerimos generar 6-7 fragmentos de P. morgani y 10-20 fragmentos de P. gracilis.

1. Transfiere los fragmentos al nuevo contenedor/placa sacándolos suavemente de la placa de Petri con una botella exprimible o una pipeta Pasteur de plástico.
2. El primer, segundo, tercer, quinto y séptimo día después de la amputación (dpa) el agua necesita ser cambiada como se describe en la Sección 1.2.

 

Nota: Girardia sp., D. dorotocephala y P. morgani regeneran completamente en 2 semanas, while P. gracilis requieren 4-6 semanas.

1. Verifica la regeneración regularmente.
2. No alimentes a las planarias antes de que el intestino y la faringe se regeneren. Después de 2 semanas, todas las especies pueden alimentarse regularmente de nuevo.

La regeneración se completa cuando el animal está adecuadamente proporcionado y la pigmentación del cuerpo es homogénea.

 

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1.5: Captura de imágenes de gusanos vivos

MATERIALES REQUERIDOS
Lentes de aumento o microscopio de disección o teléfono inteligente
Opcional: Cámara
Pipetas de Pasteur plásticas
Placas de Petri
Botella exprimible o botella estándar y Pipetas de Pasteur plásticas
Cold Instant Ocean® sal marina o agua 1x Montjuïc
Contenedor de basura

Las planarias son claramente visibles para el ojo humano cuando son más largas de 1 mm y no se requiere un microscopio durante los cambios de agua y alimentación. Cuando se analizan la salud general, la pigmentación, el comportamiento y la regeneración, se recomienda una resolución más alta. Una lente de aumento o un microscopio de disección junto con una cámara permiten la observación y la documentación de los resultados. Un teléfono inteligente funciona bien si se usa correctamente como se muestra en el video "¡Convierte tu teléfono inteligente en un microscopio digital!" (https://www.youtube.com/watch?v=KpMTkr_aiYU).

Si estás usando un microscopio de disección, la luz debería venir desde arriba de las muestras; el fondo puede ser blanco (para observar gusanos oscuros como P. gracilis o en la regeneración del ojo) o negro (para observar gusanos blancos como P. morgani o en la formación de blastemas y la regeneración de tejidos nuevos). El aumento suele ser de aproximadamente 10x.

Cuando la muestra consiste en planarias vivas, se puede grabar una película para mostrar el movimiento y el comportamiento de los gusanos. Para captar imágenes únicas de gusanos vivos, es necesario reemplazar el agua de planaria por agua fría de planaria inmediatamente antes de la captura de la imagen. El agua fría reduce el movimiento de los gusanos permitiendo la captura de imágenes más claras.

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Table1

	A largo plazo ( > 28 semanas )	A mediano plazo ( 4-28 semanas )	A corto plazo (<4 semanas )
Agua de planaria	0.5 g/ml Instant Ocean® sal marina en agua o agua 1x Montjuïc	0.5 g/ml Instant Ocean® sal marina en agua o agua 1x Montjuïc	Agua de Carolina Supply Biological Company o agua de Ward Scientific
Cambios de agua	Dos veces por semana (dos días después de la alimentación)	Una vez por semana (dos días después de la alimentación)	Cualquier cambio de agua que sea requerido
Programa de alimentos	Dos veces por semana con hígado de ternera, yema de huevo hervida o camarones de agua salada	Una vez por semana con hígado de ternera, yema de huevo hervida o camarones de agua salada	Cualquier alimentación que sea requerida

 

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References

King, R.S. & Newmark, P.A. (2013). In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology, 13, 8.

Cebrià, F. & Newmark, P.A. (2005). Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development, 132, 3691-3703.

 

 

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